本发明涉及透明质酸聚合物和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物的接枝聚合物及其制备、组合物和用途。

背景技术：

近年来，用于生物医学应用的水凝胶得到了广泛的开发。由于其高含水量、组织状弹性和相当好的生物相容性，它们已成为高度关注的重要材料。

水凝胶由亲水性均聚物或共聚物网络组成，并且能够在水或生理流体中溶胀。透明质酸(HA)(也称为透明质烷)或其透明质酸钠是天然和线性杂多糖聚合物，通常存在于脊椎动物的结缔组织和上皮组织中，分子量范围为105-107道尔顿。HA由β-1,3-N-乙酰基葡糖胺和β-1,4-葡糖醛酸的重复二糖单元组成，具有优异的粘弹性、高保水能力和高生物相容性(Lavertu等，2008，Biomacromolecules，9，640-65)。通常，HA是从公鸡鸡冠中提取的，并且目前它主要通过微藻或细菌发酵产生(Liu等，2011，Microb.Cell Fact.，10，99)。HA适用于医药、化妆品和营养品中的广泛应用(Fraser等，1997，J.Intern.Med.，242，27-33；Robert，2015，Pathol Biol，63,32-34)。特别地，已知其在软骨的润滑和体内稳态中的作用。然而，天然HA在人体中并不能长时间存在，并且由于其保留能力低和由于透明质酸酶作用而降解而从植入部位清除(Brown等，1991，Exp.Physiol.，76，125-134)。因此，HA的化学修饰，特别是交联修饰，已被考虑用于有效应用(Schante等，2011，Carbohydrate Polymers，85，469-489)。

还合成了pH或热敏聚合物，配制并形成水凝胶基质(Na，2008，Tissue Engineering and Regenerative Medicine，5,482-487；Coronado等，2011，Polymer Bulletin，67,101-124和Lee等人，2010，Soft Matter，6,977-983)。然而，由于它们的物理化学性质，这些pH或热敏聚合物仅形成凝胶基质并且不提供有效的缓冲效果。此外，它们在体内的停留时间仍然受到快速酶促HA降解的限制。

聚(N-异丙基丙烯酰胺)(文献中缩写为pNiPAM、PNIPA、PNIPAAm、NIPA、PNIPAA或PNIPAm，也以IUPAC聚[1-(异丙基氨基甲酰基)乙烯命名]，也称为N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物是高度pH或热响应性聚合物，其先前用于改性HA以赋予pH或热敏感性(Schild，1992，Progress in Polymer Science，17，163-249)。pNiPAM代表具有良好生物相容性的候选物，通过疏水结构域和原位形成水凝胶的结合引入物理交联(Tan等人，2009，Biomaterials，30,6844-6853；Cooperstein等人，2013，Biointerphases，8，19)。在热敏性低于约32℃的低临界溶解温度(LCST)的情况下，pNiPAM的疏水性N-取代基团被水分子水合以形成均匀溶液。高于LCST，N-取代基团之间的疏水相互作用增加并超过水合能，导致疏水聚合物链的聚集和水凝胶形成(Guan等，2011，Expert Opinion on Drug Delivery，8，991-1007)。尽管pNiPAM单体是不可生物降解的，但已经证明通过肾清除消除了低分子量的纯pNiPAM链(He等人，2008，Journal of Controlled Release，127,189-207)。热可逆透明质酸-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(HA-pNiPAM)水凝胶已经配制用于多个领域，如组织工程、药物输送系统等，并在体温下形成类似于纯pNiPAM的水凝胶基质(Ohya等，2001，Biomacromolecules，2,856-863)。特别地，通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)和“点击”化学，通过HA与炔基的官能化，以及在链转移剂(CTA)和含铜催化剂存在下的如此形成的HA炔丙基酰胺与叠氮基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(N3-PNIPAM)的反应，合成了热可逆透明质酸-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(HA-pNiPAM)水凝胶(WO2010/099818；Mortisen等，2010)，Biomacromolecules，11,1261-1272)。发现它们的降解产物与hTERT-BJ1成纤维细胞在35×103g·mol-1下具有细胞相容性(Mortisen等，2010，同上)。这些HA-pNiPAM凝胶基质的缺点在于它们不能提供长期润滑或缓冲效果，而且还含有残留的铜。

因此，需要找到HA衍生的聚合物，其可以在注射部位在体内提供长的停留时间，具有适当的生物力学性质，同时具有良好的耐受性和易于合成。

技术实现要素：

本发明涉及HA接枝聚合物(基于HA-N-异丙基丙烯酰胺的偶合物)的意外发现，其是能够通过温度和/或pH的变化自发形成纳米颗粒的接枝聚合物。这些新的HA接枝聚合物包含连接分子，连接分子用于将N-异丙基丙烯酰胺基聚合物接枝到HA上，赋予接枝聚合物通过温度变化(高于LCST)和/或pH形成纳米颗粒的能力，这代表使用pH和/或热敏聚合物之前从未达到的显著增强。本发明满足组织再生领域中的医学外科和美容需求，并且可以实现药物输送领域中的新用途/应用。这些新的HA接枝聚合物是pH和/或热敏聚合物接枝聚合物，它们是可注射的、稳定的、生物相容的和可生物降解的，在体内的注射部位具有长的停留时间，这是由于自发的纳米颗粒形成，具有潜在的自润滑纳米球承载(SLNBB)特性，可用作医疗或化妆品应用中的新型粘弹性补充/润滑材料。

本发明的一个方面提供了根据本发明的透明质酸和N-异丙基丙烯酰胺基的接枝聚合物(HA接枝聚合物)。

本发明的另一方面涉及包含至少一种根据本发明的HA接枝聚合物和至少一种药学上可接受的载体的药物。

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的HA接枝聚合物的纳米颗粒。

本发明的另一方面涉及化妆品组合物，其包含至少一种根据本发明的HA接枝聚合物。

本发明的另一方面涉及包含至少一种本发明的HA接枝聚合物的水凝胶。

本发明的另一方面涉及软组织填充剂，其包含至少一种根据本发明的组合物的HA接枝聚合物。

本发明的另一方面涉及制备根据本发明的HA接枝聚合物、其组合物、水凝胶，软组织填料或其纳米颗粒的方法。

本发明的另一方面涉及根据本发明的HA接枝聚合物在用于体内药物输送、体外细胞或生物组织培养和组织工程应用中的用途。

根据另一个具体实施例，提供了细胞或生物组织培养基，其包含根据本发明的HA接枝聚合物或其组合物。

根据另一个具体实施例，提供了包含根据本发明的HA接枝聚合物或其组合物的重建组织。

本发明的另一方面涉及根据本发明的HA接枝聚合物在用于预防或治疗医学病症的用途，特别是关节病、关节疾病、眼病、皮肤缺损或损伤、泌尿组织膨胀、任何组织变性、增强/改变和/或出于美学或治疗原因或用于治疗肿瘤或血管畸形的身体部位的体积的增加。

本发明的另一方面涉及根据本发明的HA接枝聚合物在制备用于预防或治疗医学病症的药物制剂中的用途，特别是关节病、关节疾病、眼病、皮肤缺陷或损伤、泌尿组织膨胀和任何组织变性、增强/改变和/或出于美学或治疗原因或用于治疗肿瘤或血管畸形的身体部位的体积的增加。

本发明的另一方面涉及根据本发明的HA接枝聚合物在用于制备细胞或生物培养基或重建组织的用途。

本发明的另一方面涉及预防、治疗或改善选自关节病、关节疾病、眼病，皮肤缺损或损伤、泌尿组织膨胀和任何组织变性、肿瘤或血管畸形的医学病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给药有效量的至少一种本发明的HA接枝聚合物或其药物制剂。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含例如冻干形式的至少一种本发明的接枝聚合物或其组合物。

本发明的另一方面涉及用于制备用于包封材料的纳米颗粒的试剂盒，例如，材料为用于预防或治疗的生物活性剂、药物、蛋白质或抗体，试剂盒包含至少一种本发明的接枝聚合物或其组合物。

附图说明

图1示出了与起始材料相比，本发明D-F的接枝聚合物在D2O中的1H NMR光谱。如实例1中所述的，A：透明质酸(HA)，B：HA-DBCO，C：pNiPAM叠氮化物封端，D：HA-B1，E：HA-B2和F：HA-P2。

图2示出了如实例2中所述测量的本发明的接枝聚合物的可注射性。A：以排出流体所需的牛顿力(N)作为具有23G针头的注射器中的活塞的行程距离(距离％)的函数。评估三种力以对注射曲线进行表征：Fi(初始力)、Fp(平台力)和Ff(最终力)。B：23G(B1)和29G(B2)在20℃针头注射器系统中的HA接枝聚合物注射曲线的概述。空注射器、和PBS用作对照。C：29G针在37℃下的HA接枝聚合物注射曲线的概述。

图3示出HA-B1(A)、HA-B2(B)、HA-P2(C)和HA-pNiPAM接枝聚合物(阴性对照)(D)的SEM显微照片。比例尺＝1μm，并且如实例4中所述测量的，形成的纳米颗粒的百分比作为通过纳米颗粒跟踪分析(E)测量的温度的函数(从40至25℃，3分钟/步骤)。

图4示出了如实例7中所述在37℃下来自盐溶液、Ostenil、HA-B2和HA-P2的地塞米松的累积体外药物释放曲线。28小时后，通过加热(121℃)水解聚合物基质，测量地塞米松的剩余含量。

图5示出了如实例5中所述在健康小鼠中皮下注射并在骨关节炎小鼠模型中关节内注射7天后，小鼠中HA-Cy5和HA-P2-Cy5活体荧光叠加白色光图像的增加的停留/持续存在的实例。

具体实施方式

术语“聚乙二醇(PEG)链”是指包含2至约5000个乙二醇单元，优选2至6或2至4个乙二醇单元的链。

术语“透明质酸”(HA)是指由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺组成的线性杂多糖，它们通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接在一起。根据本发明的合适的HA聚合物包括由多达12500个二糖重复组成的多糖，取决于来源，其尺寸范围为约500至5000000Da，特别是约500至3000000Da。每个重复单元在D-葡糖醛酸基序上带有羧基化学基团，其可以潜在地连接以形成根据本发明的接枝聚合物。根据一个具体方面，用本发明的连接基团取代那些羧基的取代度为约0.5-50％，通常为2-10％。

本文所用的术语“交联度或取代度”是指相对于最初存在于HA和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物上的官能团对的总量，转化为交联键或接枝键的官能团对的量，表示为百分比。

根据本发明的合适的HA聚合物可以具有各种来源，包括天然(通常是动物)、半合成或生物技术(例如非动物，通过微生物发酵产生)。

术语“N-异丙基丙烯酰胺基聚合物”包括由IUPAC N-丙-2-基丙-2-烯酰胺(CAS号2210.25.5)命名的所有聚合物。根据本发明的合适的聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物包括分子量为约500至35000Da，特别是2000至25000Da的聚合物。

术语“偶合的”或“接枝的”用于表示产生本发明的接枝聚合物或偶合物的HA和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物之间的共价键的形成，其中这种共价键通过本发明的连接基团产生。

术语“点击”化学是指各种化学反应(例如叠氮化物-炔烃环加成反应)，其特征为其高产率、区域选择性、稳定性和进行的能力而不产生如Kolb等人，201，Chem.Int.Ed Engl.，40(11)，2004-2021所述的令人不快的副产物。重要的是，这些反应可以在良性溶剂中发生，对水和氧不敏感，并且具有高的热动力驱动。这些反应的最常见的实例是由不饱和物质的环加成、亲核取代化学、非醛醇羰基化学和碳-碳多键的添加产生的碳杂原子键形成。本发明的接枝聚合物可以通过点击化学合成，并且本文提供了合成路线的实例，本领域技术人员可以使用标准知识对其进行略微调整。

当单独使用或与其它术语组合使用时，术语“烷基”包括C1-C20烷基的直链或支链，其是指具有1-20个碳原子的一价烷基。该术语的例子有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、正庚基、n-辛基、正壬基、正癸基、四氢锗基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十八烷基、正十九烷基和正二十烷基等。优选地，这些包括C1-C9烷基，更优选C1-C6烷基，特别优选C1-C4烷基，其类似地分别指具有1至9个碳原子的一价烷基，具有1至6个碳原子的一价烷基以及具有1-4个碳原子的一价烷基。特别地，那些包括C1-C6烷基。

术语“C5-C10环烷基”是指具有5-10个碳原子的饱和或不饱和碳环基团，其具有单环，例如C6-C8环烷基(例如环己基、环辛基)或多个稠环(例如降冰片基)。C3-C8-环烷基包括环戊基、环己基、环丙基、环丁基、降冰片基等。

术语“杂环烷基”是指根据上述定义的C5-C10-环烷基，其中至多x个碳原子被选自O、S、NR的杂原子取代，R被定义为氢或甲基。杂环烷基包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢呋喃基、氮杂环辛基等。

术语“C8环烷基”是指具有单环(例如，环辛基)或多个稠环的8个碳原子的饱和或不饱和碳环基团(例如，二苯并环辛炔基、单氟化环辛炔、二苯并环辛炔、二氟环辛炔、二芳基环辛酮、环辛炔、二苯并氮杂环辛炔、非氟环辛炔、无芳基环辛炔、二环壬烷和二甲氧基氮杂环辛炔)或如Debets等，2011，Accounts for Chemical research，44(9)，805-815中所述的那些。

术语“C8杂环烷基”是指根据上述定义的C8环烷基，其中至多3个碳原子被选自O、S、NR的杂原子取代，R被定义为氢或甲基。C8杂环烷基包括任选取代的氮杂-二苯并环辛炔基等。

术语“烷氧基羰基”是指基团-C(O)OR，其中R包括“C1-C6烷基”、“芳基”、“杂芳基”、“芳基C1-C6烷基”、“杂芳基C1-C6烷基”或“杂烷基”。

术语“烷氧基羰基C1-C6烷基”是指具有烷氧基羰基取代基的C1-C6烷基，包括2-(苄氧基羰基)乙基等。

术语“氨基”是指基团-NRR\'，其中R和R\'独立地为H、“C1-C6烷基”、“芳基”、“杂芳基”、“C1-C6烷基芳基”、“C1-C6烷基杂芳基”、“环烷基”或“杂环烷基”，和其中R和R\'与它们所连接的氮原子一起，可任选地形成3-8元杂环烷基环。

术语“氨基烷基”是指具有氨基取代基的烷基，包括2-(1-吡咯烷基)乙基等。

术语“氨基羰基”是指基团-C(O)NRR\'，其中R和R\'独立地为H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、“芳基C1-C6烷基”或“杂芳基C1-C6烷基”，包括N-苯基羰基等。

术语“氨基羰基C1-C6烷基”是指具有氨基羰基取代基的烷基，包括2-(二甲基氨基羰基)乙基、N-乙基乙酰胺基、N,N-二乙基-乙酰胺基等。

术语“酰氨基”是指基团-NRC(O)R\'，其中R和R\'独立地为H、“C1-C6烷基”、“C2-C6链烯基”、“C2-C6炔基”、“C3-C8-环烷基、“杂环烷基”、“芳基”、“杂芳基”、“芳基C1-C6烷基”、“杂芳基C1-C6烷基”、“芳基C2-C6链烯基”、“杂芳基C2-C6链烯基”、“芳基“C2-C6炔基”、“杂芳基C2-C6炔基”、“环烷基C1-C6烷基”或“杂环烷基C1-C6烷基”，包括乙酰氨基等。

术语“酰氨基C1-C6烷基”是指具有酰氨基取代基的C1-C6烷基，包括2-(丙酰氨基)乙基等。

术语“酰基”是指基团-C(O)R，其中R包括H、“烷基”，优选“C1-C6烷基”、“芳基”、“杂芳基”、“C3-C8-环烷基”、“杂环烷基”、“芳基C1-C6烷基”、“杂芳基C1-C6烷基”、“C3-C8-环烷基C1-C6烷基”或“杂环烷基C1-C6烷基”，包括乙酰基等。

术语“酰基C1-C6烷基”为具有酰基取代基的C1-C6烷基，包括2-乙炔基等。

除非另外受单个取代基的定义限制，否则术语“取代的”是指被1至5个取代基取代的基团，取代基选自“C1-C6烷基”、“C2-C6链烯基”、“C2-C6炔基”、“C3-C8-环烷基”、“杂环烷基”、“C1-C6烷基芳基”、“C1-C6烷基杂芳基”、“芳基C1-C6烷基”、“杂芳基C1-C6烷基”、“C1-C6烷基环烷基”、“C1-C6烷基杂环烷基”、“氨基”、“氨基磺酰基”、“铵”、“酰基氨基”、“氨基羰基”、“芳基”、“杂芳基”、“亚磺酰基”、“磺酰基”、“烷氧基”、“烷氧基羰基”、“氨基甲酸酯”、“硫烷基”、“卤素”、三卤甲基、氰基、羟基、巯基、硝基等。

术语“药学上可接受的”是指由不是生物学上或其他方面不合需要且不是特别有毒的物质组成的载体。

术语“双相水凝胶”在本文中用于描述低于临界溶解温度(LCST)的状态，其特征为凝聚的凝胶纳米颗粒在低粘度、凝胶状连续相中悬浮。

术语“单相水凝胶”和“单相接枝聚合物溶液”可互换使用以描述LCST以下的可流动单相状态。根据本发明的一个方面，根据本发明的HA接枝聚合物在LCST处经历单相水凝胶和双相水凝胶之间的过渡，LCST为约25℃至约32℃，例如在体温下。

术语“载体”是指除活性剂之外的药物制剂中存在的任何组分，因此包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。

术语“生物活性剂”用于描述具有生物活性的任何试剂，其掺入本发明的接枝聚合物组合物中。它可以是天然的、合成的、半合成的或其衍生物，并且可以包括疏水的、亲水的、可溶的和不溶的化合物。更具体地，它可以是任何生物活性剂，其可用于治疗和/或预防和/或诊断哺乳动物(例如动物和人类，特别是人类)中已知的任何治疗区域中的病症，其包括但不限于炎性疾病(包括关节炎、骨关节炎和类风湿性关节炎)、眼病、肿瘤和感染。生物活性剂可选自大分子化合物或小分子化合物，例如肽、蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸、抗生素、抗微生物剂、生长因子、酶、抗肿瘤药物、抗炎药物、抗病毒药物、抗菌药物、抗真菌药、麻醉药、抗肿瘤药、镇痛药、抗凝药、止血药和抗体。更具体地，至少一种生物活性剂可选自皮质类固醇和p38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂。

术语“皮肤病症”或“皮肤病”包括皮肤损伤，其中皮肤表面呈现疼痛性疼痛而不必在其表面上切割，例如与年龄相关的组织损伤(例如皱纹)、伤口和疤痕，例如痤疮或风疹伤疤。这些疾病还包括伤口、疤痕、牛皮癣、痤疮、湿疹和酒渣鼻。术语“伤口”包括任何受损组织，例如在创伤或手术后。哺乳动物的伤口包括例如擦伤撕裂伤、挫伤、脑震荡、刺伤、皮肤切割、手术伤口、枪伤、热伤、化学伤口、咬伤和叮咬以及电伤口。它还包括慢性皮肤病，如溃疡。

术语“眼病或病症”是影响眼睛，特别是角膜的病症或损伤。此类疾病包括角膜磨损、角膜划痕、角膜碱烧伤、年龄相关性黄斑变性、眼球凸出、白内障、巨细胞病毒性视网膜炎、色盲、斜视、糖尿病性黄斑水肿、眼睛浮肿和眼睛闪光、青光眼、圆锥角膜、懒惰眼、低视力、高眼压、视网膜脱离、眼睑抽搐、葡萄膜炎、干燥性角膜结膜炎(KCS)和干眼症。

术语“关节病”包括骨关节炎、关节炎疼痛、类风湿性关节炎、感染和炎症疼痛、导致软骨、骨、韧带或滑膜囊损伤的创伤性膝关节事件。

术语“重建组织”是指生物组织(内源性或外源性)或可用于修复受损的身体组织(例如表皮、神经、软骨或骨组织)的合成或半合成材料。

如本文所用，“治疗”和“治疗”等通常意指获得所需的药理学和/或物理和/或生理学效果。就预防或部分预防疾病、症状或病症而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈由疾病引起的疾病、病症、症状或副作用而言可以是治疗性的。本文所用的术语“治疗”包括哺乳动物、特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为拥有疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或者缓解疾病，即引起疾病和/或其症状或病症的消退，例如改善或修复损伤。

如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物。例如，本发明考虑的哺乳动物包括人、灵长类动物和家养动物，如牛、羊、猪、马(特别是赛马)、实验室啮齿动物等。

根据本发明的治疗的术语“功效”可以基于响应于根据本发明的用途的疾病过程中的变化来测量。例如，根据本发明的治疗的功效可以通过减少关节疼痛、改善关节的润滑、改善受试者的活动性、改善眼表面或降低眼压来测量。

根据本发明的接枝聚合物

根据一个实施例，提供透明质酸聚合物和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物的接枝聚合物，其中透明质酸聚合物和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物通过至少一个式(II)的连接基团L偶合：

其中Ra和Rb中的一个与N-异丙基丙烯酰胺基聚合物共价连接，并且Ra和Rb中的一个与透明质酸聚合物共价连接，并且当Ra或Rb与N-异丙基丙烯酰胺基聚合物共价连接时，它等于R1，并且当Ra或Rb与透明质酸聚合物共价连接时，它等于R3，其中R1选自以下基团：-(CH2)x-NH-(CH2)y-S-、-(CH2)x-NH-OC(O)-(CH2)y-S-、-(CH2)x-NH-(CH2)yC(O)-NH-(CH2)z-S-、-(CH2)xOC(O)-CR7R8-、-C(O)-(CH2)xC(O)-NH-(CH2)y-S和聚乙二醇(PEG)链，其中R7和R8是任选取代的C1-C6烷基，例如甲基；R3是基团-E-G-L1-，其中E不存在或选自-C(O)-NR9-、-C(O)-O-和-C(O)-，G是选自以下基团的连接基团：任选取代的C1-C20烷基(例如乙基)、任选取代的聚乙二醇(PEG)链、任选取代的酰氨基C1-C6烷基、任选取代的酰基C1-C6烷基、任选取代的氨基羰基C1-C6烷基和任选取代的C1-C6烷氧基，并且L1选自-NR10C(O)-、-C(O)-NR10-、-C(O)-O-和-C(O)-，其中R9和R10独立地选自H和任选取代的C1-C6烷基，例如甲基；A是任选取代的C5-C10-环烷基，或任选取代的杂环烷基，例如任选取代的C8环烷基或任选取代的C8杂环烷基环，其中R5代表独立地选自以下基团的一个或多个基团：H、任选取代的烷氧基(如甲氧基)和任选取代的C1-C6烷基(如甲基)；x、y和z是独立地选自1至20的整数；或其任何药学上可接受的盐。

根据一个具体实施例，提供式(I)的HA接枝聚合物：

其中M是选自式(M1)和式(M2)的基团：

R2是基团-B-(CH2)i-D，其中B不存在或选自-S-C(S)-S-和-S-；D选自以下基团：任选取代的C1-C15烷基的基团，例如任选取代的甲基、乙基、丁基、丙基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基(例如任选取代的C1-C4烷基，例如任选取代的甲基或乙基)，任选的取代的烷氧基羰基C1-C4烷基，任选取代的氨基C1-C4烷基，任选取代的氨基羰基C1-C6烷基，-COOH和-NH2；p是独立地选自1至500的整数；i是独立地选自0至500的整数；R6是选自-COOH和R3的基团，取决于取代度；L是如本文所定义的式(II)的连接基团，n是选自1至7000的整数；或其任何药学上可接受的盐。

根据一个具体实施例，提供了式(I)的偶合物，其中连接基团L通过其Rb取代基与偶合物的HA部分连接。

根据一个具体实施例，提供了式(I)的偶合物，其中连接基团L通过其Ra取代基与偶合物的HA部分连接。

根据一个具体实施例，提供了式(I)的偶合物，其中R1是基团-(CH2)x-O-C(O)-CR7R8-，其中R7和R8是任选取代的C1-C6烷基，例如甲基。

根据另一具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R1是基团-C(O)-(CH2)x-C(O)-NH-(CH2)y-S。

根据特定实施例，提供式(I)的偶合物，其中x为3。

根据另一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中x为2。

根据另一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中y为2。

根据另一具体实施例，提供式(Ia)的HA接枝聚合物：

或其任何药学上可接受的盐，其中L、R2、R6和p如本说明书中所述。

根据具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中A是任选取代的C8环烷基或任选取代的C8杂环烷基环。

根据进一步的具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中A是任选取代的氮杂-二苯并环辛炔基。

根据特定实施例，提供式(I)的偶合物，其中p约为50至200。

根据特定实施例，提供式(I)的偶合物，其中R7和R8是任选取代的C1-C6烷基，特别是甲基。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中B是-S-C(S)-S-。

根据一个具体实施例，提供了式(I)的偶合物，其中B不存在。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中i为0至20，特别是0至15，例如0至11，特别是11。

根据一个具体实施例，提供了式(I)的偶合物，其中D是任选取代的C1-C4烷基，例如任选取代的甲基(例如任选被C1-C12烷基取代的甲基)。

根据具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(IIa)的基团：

其中A、R1、R3和R5如本文所述。

根据具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(IIb)的基团：

其中A、R1、R3和R5如本文所述。

根据具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(II\')的基团：

其中R11和R12代表一个或多个独立地选自以下基团的取代基：H、任选取代的烷氧基(如甲氧基)和任选取代的C1-C6烷基(如甲基)，Ra和Rb如本文所述。

根据进一步的具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(IIa\')的基团：

其中R11和R12代表一个或多个独立地选自以下基团的取代基：H、任选取代的烷氧基(如甲氧基)和任选取代的C1-C6烷基(如甲基)，R1和R3如本文所述。

根据另一个进一步的具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(IIb\')的基团：

其中R11和R12代表一个或多个独立地选自以下基团的取代基：H、任选取代的烷氧基(如甲氧基)和任选取代的C1-C6烷基(如甲基)，R1和R3如本文所述。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中连接基团G是任选取代的酰氨基C1-C6烷基，特别是用PEG基团取代的酰氨基C1-C6烷基，例如下式的基团：-C1-C6烷基-NH-C(O)-(CH2-CH2-O)j-CH2-CH2-，其中j选自1 1至10，特别是1至8或1至6，例如j为1、2、3或4，特别是4。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中连接基团G是C1-C20烷基，例如任选被任选取代的聚乙二醇(PEG)链取代的甲基，例如下式的基团：-C1-C6烷基-(CH2-CH2-O)j-CH2-CH2-，其中j选自1至10，特别是1至8或1至6，例如，j是1、2、3或4，特别是4。

根据具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中连接基团G是任选取代的C1-C20烷基，例如甲基。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中E不存在。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中E是-C(O)-。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中R3是如本文所述的基团-E-G-L1-，其中L1是-NR10C(O)-。

根据特定实施例，R10是H。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(II)的基团，特别是具有下式(II”)的(IIa\')：

其中Q不存在或是下式的基团：-NH-C(O)-(CH2-CH2–O)1-4-CH2-CH2-，R11和R12如本文所述。

根据一个具体实施例，提供式(I)的偶合物，其中L是根据式(II)的基团，特别是具有下式(II”\')的(IIb\')：

其中G1是PEG，并且在更具体的实施例中是式-(CH2-CH2-O)1-4-的基团，例如-(CH2-CH2-O)2-，R11和R12如本文所述。

根据特定实施例，R11和R12是H。

根据一个具体实施例，提供选自下式的式(I)的偶合物：

取代度为约0.5-50，优选约2-10，或其任何药学上可接受的盐。

根据一个具体实施例，本发明的偶合物的药学上可接受的盐包括例如钠、钾、铵和钙。

根据一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是如本文所定义的基团-E-G-L1-，其中E不存在。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是如本文所定义的基团-E-G-L1-，其中E是-C(O)-。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是如本文所定义的-EG-L1-基团，其中G是任选取代的C1-C20烷基，例如选自甲基、乙基和丙基。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是如本文所定义的基团-E-G-L1-，其中L1是-C(O)-O-。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是基团-O-(CH2)-C(O)-O-。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的透明质酸聚合物的接枝聚合物，其中R3是基团-(CH2)3-C(O)-O-。

应当理解，本发明的偶合物的分子量可以通过选择起始材料来调整，并且其选择取决于本发明的接枝聚合物组合物、制剂和由其形成的水凝胶的预期功能。例如，所需的接枝聚合物组合物降解速率、任选掺入其中的生物活性剂的所需释放速率，待处理的治疗条件将影响本发明的偶合物的分子量选择。

在一个实施例中，用于润滑/填料组合物的本发明的接枝聚合物的分子量可选自约2000至约250000000Da，优选约500000至约10000000。

在另一个实施例中，用于或作为药物输送系统的本发明的接枝聚合物的分子量可选自约2000至约250000000Da，优选约500000至约10000000。

根据本发明的偶合物的制备

根据本发明的新型HA偶合物可以通过使用无铜“点击”化学和以下一般方法和程序从容易获得的起始材料制备。应当理解，在给出典型或优选的实验条件(即反应温度、时间、试剂的摩尔数、溶剂等)的情况下，除非另有说明，否则也可以使用其他实验条件。最佳反应条件可随所用的特定反应物或溶剂而变化，但这些条件可由本领域技术人员使用常规优化程序确定。获得式(I)的偶合物的一般合成方法是使带有N-异丙基丙烯酰胺基聚合物的叠氮化物与带有环辛炔部分的HA聚合物反应或使带有HA聚合物的叠氮化物与带有环辛炔部分的N-异丙基丙烯酰胺基聚合物反应。

根据本发明的一个方面，提供了制备透明质酸聚合物和N-异丙基丙烯酰胺基聚合物的接枝聚合物的方法，其中透明质酸聚合物和N-异丙基丙烯酰胺基团通过至少一个式(II)的连接基团L偶合，包括以下步骤：

(a)提供具有至少一个羧酸基团的HA聚合物，羧酸基团与至少一个能够参与“点击化学”反应的第一官能团偶合；

(b)提供具有至少一个第二互补官能团的N-异丙基丙烯酰胺基聚合物，所述第二互补官能团能够参与与第一官能团的“点击化学”反应，其中所述官能团之一是叠氮部分，而另一个官能团是所述连接基团L的含炔前体；

(c)通过“点击化学”反应使HA多糖的至少一个第一官能团与N-异丙基丙烯酰胺基聚合物的至少一个第二互补官能团反应，以得到本发明的接枝聚合物组合物；和

(d)分离接枝聚合物组合物。

根据另一具体实施例，本发明的方法可以包括其他步骤：在步骤d)中获得的接枝聚合物组合物中物理分散和/或共价连接和/或添加至少一种生物活性剂。

用于获得式(I)，特别是式(Ic1)的偶合物的一般合成方法在以下方案1中示出。根据式(I)的HA偶合物，其中R1、R2、R3、R5、R6和p在详细说明书中定义，可以由定制或市售原料通过在合适的溶剂(例如水-DMSO混合物，体积比为1：1)中的点击化学在单个化学步骤中制备。

中间体(Ia1)可以是市售的或通过酰胺化、酯化、硫醚化、氧化或Ugi缩合使其中一个官能团是叠氮部分的化合物与N-异丙基丙烯酰胺基聚合物反应制备。

中间体(Ib1)可以是市售的或通过如Schanté等，2011，Carbohydrate Polymers，85，469-489中所述的酰胺化、酯化、硫醚化或马来酰亚胺-巯基反应、氧化或Ugi缩合使式(Lprec1)的连接基团前体与透明质酸或其任何药学上可接受的盐反应制备。

其中A和R5如本文所定义且R3\'是基团-E-G-L1\'，其中E和G如本文所定义且L1\'是氨基。

方案1

用于获得式(I)，特别是式(Ic2)的偶合物的另一种通用合成方法在下面的方案2中示出，由定制或市售原料通过在适当溶剂(例如水和/或二甲基亚砜等)中的点击化学在一个单一化学步骤中制备。

方案2

中间体(Ia2)可以是市售的或通过使式(Lprec2)的连接基团前体与N-异丙基丙烯酰胺基聚合物通过酰胺化、酯化、硫醚化、氧化或Ugi缩合反应制备。

其中A和R5如本文所定义，R1\'是醇、羧酸、羰基、叠氮化物、硫代酯、马来酰亚胺、酰基磷酸酯、酸酐、酰氯、羧酸酯氨基或酯基。

中间体(Ib2)可以是市售的，或通过酰胺化、酯化、硫醚化、氧化或Ugi缩合使其中一个官能团是叠氮部分的化合物与透明质酸或任何药学上可接受的盐反应制备。

根据特定实施例，提供中间体(Ia2)

其中A、R1、R2、R5和p如本文所定义。

组合物

本发明提供药物或治疗剂作为组合物，或包含其的医疗装置和治疗受试者(优选哺乳动物患者)的方法，最优选患有医学病症的人类患者，特别是关节病、关节疾病、眼病变(如年龄相关性黄斑变性、眼球凸出、白内障、巨细胞病毒性视网膜炎、色盲、斜视、糖尿病性黄斑水肿、眼球浮肿和眼睛闪烁、青光眼、圆锥角膜、懒惰眼、视力低下、高眼压、视网膜脱离、眼睑抽搐和葡萄膜炎)、皮肤缺损或损伤(如伤口、疤痕、牛皮癣、痤疮、湿疹和红斑痤疮)和任何组织变性(如压力性尿失禁、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、混合结缔组织病、银屑病关节炎、马凡综合征、佩罗尼病，ehlers-Danlos综合征、成骨不完全、粘滞综合征、alport综合征、先天性挛缩性蛛网膜下腔炎、Loeys-Dietz综合征和坏血病。

在一个具体实施例中，本发明提供了用作药物的药物制剂，其包含至少一种本发明的偶合物或组合物。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物是肠胃外制剂。

在一个具体实施例中，本发明的组合物是可注射制剂，例如关节内、动脉内、静脉内、滑膜内、皮内、皮下、粘膜下、间质和肌肉内制剂。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物是口服制剂。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物是局部制剂。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物是眼用制剂。

或者，本发明提供了可以在另一种哺乳动物中使用的组合物，因此用于与上述相同的用途。

本发明还提供可用于化妆品应用、重建手术(例如组织重建)和细胞或生物组织培养(例如干细胞培养)的组合物或医疗装置。那些组合物还分别包含化妆品可接受的载体或细胞或生物组织培养营养素。

根据本发明的组合物包含软组织填充剂组合物，例如皮肤和皮下填充剂，其包含至少一种本发明的偶合物或水凝胶或其纳米颗粒。基于HA的软组织填充剂组合物的制备是本领域技术人员公知的，并且可以例如如下所述，Jeon等，2007，Carbohydrate Polymers，2007.70(3)：p.251-257，Iannitti等，2013，Int.J.Pharm.，456：583-592。

根据一个具体实施例，当在20℃下以振荡模式在约100Hz下测量时，本发明的组合物具有约0.001Pa*s至约100Pa*s的粘度，优选约0.1至10Pa.s。

根据一个具体实施例，通过29计量注射针的挤出速率为约1mm/分钟时，本发明的组合物在25℃下的挤出力为约0.01N至约20N，优选为约1N至约5N。

根据一个具体实施例，在水性溶剂中溶解后，本发明的接枝聚合物组合物可形成pH和/或热敏水凝胶，其显示出随温度变化的单相-双相相变。

根据一个具体方面，本发明的接枝聚合物组合物形成单相水凝胶和低于LCST的“单相接枝聚合物溶液”，LCST从约25℃至约32℃。根据另一个具体方面，本发明的接枝聚合物组合物在这种较低临界溶解温度以上形成双相水凝胶。

在特定的实施例中，本发明的接枝聚合物组合物可以在约25℃至约32℃的温度下自发形成纳米颗粒，例如在体温下。

此外，本发明的接枝聚合物组合物具有进行这种可逆的纳米颗粒形成的优点，因此在储存和运输过程中潜在的温度效应不会不可逆地影响聚合物的物理状态。

在特定的实施例中，提供了本发明的接枝聚合物组合物的纳米颗粒，其平均尺寸为约40-500nm。

根据另一个具体实施例，本发明的组合物可以是pH和/或热可逆水凝胶的形式，其是可生物降解的和生物相容的。特别地，本发明的组合物可以是pH和/或热可逆生物可降解水凝胶的形式，其在室温或低于室温或更低的温度下呈单相(溶液或液体)状态，并且在生理(或体内)温度或更高时处于凝胶状态。

本发明的组合物还可包含一种或多种药学上可接受的其他成分，例如明矾、稳定剂、抗微生物剂、缓冲剂、着色剂、调味剂、佐剂等。

根据本发明的组合物与常规使用的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂一起可以以药物组合物的形式放置，并可以固体形式使用，例如片剂或填充胶囊或液体，如溶液、悬浮液、软膏、乳液、酏剂或填充有相同剂、薄膜或凝胶的胶囊，均用于口服。该组合物还可以配制成干燥产品，用于在使用前用水或另一种合适的载体重建。

本发明的组合物作为液体制剂，包括但不限于水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆和酏剂。

这些液体制剂可含有添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、非水性载体和防腐剂。悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪。乳化剂包括但不限于卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯和阿拉伯胶。防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。分散剂或润湿剂包括但不限于聚(乙二醇)、甘油、牛血清白蛋白、Tween、其他材料以及配方加工技术等列于药学的科学与实践(雷明顿：药学的科学与实践)，第22版，2012，Lloyd，Ed.Allen，Pharmaceutical Press，其通过引用并入本文。

本发明的固体组合物可以是以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。例如，用于口服给药的片剂和胶囊可含有常规赋形剂，包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂。粘合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂包括但不限于乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨糖醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂包括但不限于马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠。润湿剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。可根据本领域熟知的方法包衣片剂。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物或水凝胶还包含生物活性剂，其分散在接枝聚合物组合物中或共价连接到接枝聚合物组合物上。

在另一个具体实施例中，本发明的组合物或水凝胶是生物活性剂输送系统的形式。

在一个实施例中，基于接枝聚合物组合物或本发明的水凝胶的总量，至少一种生物活性物质可以以约0.001wt％至40wt％，优选约0.01wt％至30wt％的量存在。

根据另一方面，根据本发明的组合物包含细胞或生物组织培养基，其包含HA接枝聚合物或其组合物。该培养基可以进一步包含细胞营养素，例如葡萄糖、维生素、生长因子、金属离子等。

根据另一方面，根据本发明的组合物包含生物组织(内源性或外源性)或可用于修复受损的身体组织(例如表皮、神经、软骨或骨组织)的合成或半合成材料。

在另一个具体实施例中，提供了制备培养基的方法，该方法包括将根据本发明的HA接枝聚合物与细胞培养营养物(如葡萄糖、维生素、生长因子、金属离子等)混合的步骤。

在另一个具体实施例中，提供了制备重建组织的方法，包括将根据本发明的HA接枝聚合物或其组合物与用于修复受损的身体组织(例如干细胞或表皮、神经、软骨或骨组织)的材料、组织或细胞组合的步骤。

在另一个具体实施例中，提供了制备本发明的接枝聚合物组合物或水凝胶的方法，特别是用于活性成分的输送系统，其包括以下步骤：

-以凝胶状态提供本发明的接枝聚合物或其组合物或水凝胶；

-提供要输送的活性成分；

-将本发明的接枝聚合物或其组合物或水凝胶与所述活性成分(例如药物)混合；

-任选通过提高混合物的温度(通常约25至约40℃)诱导纳米颗粒的形成；

-收集如此获得的组合物、水凝胶或载有活性成分的纳米颗粒(例如药物)。

根据一个具体方面，本发明的组合物、水凝胶或纳米颗粒一旦加载有活性成分，就可用于所述活性成分注射的给药和原位释放。

给药方式

本发明的组合物可以通过口服途径的任何方式给药，包括口腔的粘膜表面，包括牙龈、口腔底部、面颊、嘴唇、舌头、牙齿。

本发明的组合物还可以通过注射的任何方式给药，例如皮下注射、滑膜内、动脉内、静脉内、关节内、肌内、皮下、粘膜下和间质注射。

本发明的组合物还可以局部给药于皮肤、各种粘液或眼睛。

组合

根据一个方面，本发明的聚合物或其任何合适的药学上可接受的和其药物制剂可以单独给药或与至少一种助剂组合给药。

根据一个具体方面，根据本发明的助剂包括纯HA、硫酸软骨素或另一种关节内药物组合物以及根据本发明的生物活性剂。

本发明包括将本发明的偶合物及其药物制剂与至少一种用于治疗炎性疾病(包括关节炎、骨关节炎和类风湿性关节炎)、眼病、肿瘤和感染的助剂同时或依次给药。这些助剂可选自抗生素、抗微生物剂、生长因子、酶、抗肿瘤药物、抗炎药物如皮质类固醇、抗病毒药物、抗菌药、抗真菌药、麻醉药、抗肿瘤药、镇痛药、抗凝血药和止血药。

与所述助剂同时给药的本发明的聚合物、纳米颗粒或水凝胶或其药物制剂可以在相同或不同的组合物中给药，并且通过相同或不同的给药途径给药。

本发明的组合物中的本发明的聚合物、纳米颗粒或其水凝胶的浓度范围可根据目标和/或所需的每种情况、潜在疾病、临床适应症和所需的疼痛缓解强度而变化。

根据一个实施例，提供了药物制剂，其包含至少一种本发明的偶合物或其任何合适的药学上可接受的药物，其与至少一种本文所述的助剂和至少一种药学上可接受的载体组合。

作为单剂量或多剂量给予个体的剂量将根据多种因素而变化，包括药代动力学性质、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康和大小)、症状程度、同时治疗、治疗频率和所需效果。

患者

在一个实施例中，根据本发明的患者是患有或有患任何组织变性、关节疾病、眼病、皮肤缺陷或损伤的风险的受试者。

在另一个实施例中，根据本发明的患者是患有或有患关节病症和关节疾病风险的受试者，例如骨关节炎、关节炎、感染、类风湿性关节炎和导致软骨、骨、韧带或滑膜囊损伤的创伤性膝关节事件。

在另一个实施例中，根据本发明的患者是患有或有患眼病的风险的受试者，例如年龄相关性黄斑变性、眼球凸出、白内障、巨细胞病毒性视网膜炎、色盲、斜视、糖尿病性黄斑水肿、眼睛漂浮物和眼睛闪光、青光眼、圆锥角膜、懒惰眼、低视力、高眼压、视网膜脱离、眼睑抽搐和葡萄膜炎。

在另一个实施例中，根据本发明的患者是患有或有患皮肤缺陷或损伤的受试者，例如疤痕、擦伤、撕裂、脑震荡、刺伤、皮肤切割、手术伤口、枪伤、热伤、化学品伤口、咬伤和叮咬以及电伤口。它还包括慢性皮肤病，如溃疡。

在另一个实施例中，出于美学或治疗原因，根据本发明的患者是愿意或需要身体部位体积增强或解剖学重塑的受试者，例如泌尿组织膨胀、身体部位的任何增强/改变和/或增加。

在另一个进一步的实施例中，根据本发明的患者是患有肿瘤或血管畸形的受试者。

根据本发明的用途

根据一个具体实施例，本发明的HA偶合物及其组合物可用于各种应用，例如体外细胞或生物组织培养，作为组织填充剂，用于化妆品和组织工程应用。

根据另一个具体实施例，提供了根据本发明的接枝聚合物或水凝胶或纳米颗粒用于制备输送系统、体外细胞或生物组织培养物或组织工程材料的用途，例如神经外科、骨、软骨、表皮重建组织)。

根据另一具体实施例，本发明的HA偶合物及其组合物可用于预防或治疗医学病症，特别是关节病、关节疾病、眼病、皮肤缺损或损伤、泌尿组织膨胀、任何组织变性、出于美学或治疗原因或用于治疗肿瘤或血管畸形的身体部位的体积增强/改变和/或增加。

根据另一具体实施例，本发明的制剂可以在单相水凝胶形式下使用，在LCST以下用于注射到肿瘤的毛细血管床或血管畸形中，其中所述制剂在暴露于体温(高于LCST)时形成原位小水凝胶颗粒，从而允许血管栓塞。由此产生的所述肿瘤或血管畸形的栓塞导致血液和营养物进入的阻断，并且可用于直接杀死肿瘤或用于为进一步的手术切除或治疗作准备，例如与放射疗法或化学疗法组合。

根据本发明的另一个具体方面，提供了本发明的HA偶合物及其组合物，其用于血管栓塞。

根据另一个进一步的特定方面，提供了本发明的HA偶合物及其组合物，用于美容用途和用于美容和重建手术。

根据另一个进一步的特定方面，提供了本发明的HA偶合物及其组合物，其用于体内药物输送。

根据一个具体实施例，提供了pH和/或热敏生物可降解水凝胶，其包含至少一种本发明的HA偶合物，其可用于许多医学应用，例如用于至少一种生物活性剂的输送系统或组织工程中的细胞输送系统，细胞或生物组织培养系统等。

根据一个具体方面，提供了根据本发明的水凝胶作为至少一种生物活性剂的输送系统的用途。

在本发明的另一个实施例中，提供了至少一种本发明的HA偶合物或其任何合适的药学上可接受的组合物与至少一种助剂组合用于制备用于预防或治疗组织变性和相关疾病的药物制剂的用途。

根据一个具体方面，提供了本发明的HA偶合物及其组合物，其中所述偶合物能够原位自发地形成纳米颗粒。

下面将以更详细的方式并参考附图中所示的实施例来描述说明本发明的实例。

实例

以下缩写分别指下面的定义：

DMSO(二甲基亚砜)，MWCO(截留分子量)。

实例1：本发明的透明质酸偶合物的合成

如以上方案1中所述合成本发明的偶合物，其中用于构建连接基团的起始材料(连接基团前体)是：

二苯并环辛炔-胺(DBCO-胺)(式(L-prec1)，其中A是C8杂环烷基环，是二苯并环辛炔，R5是H且R3\'是-E-G-L1\'基团，其中E是-C(O)-，G是乙基，L1\'是购自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)的-NH2)。二苯并环辛炔-PEG4-胺(DBCO-PEG4-胺)式(L-prec1)，其中A是C8杂环烷基环，是二苯并环辛炔，R5是H且R3\'是-E-G-L1\'基团，其中E是-C(O)-，G是-NH-C(O)–(CH2-CH2-O)4-CH2-CH2-，且L1\'是购自Click Chemistry Tools(Scottsdale，Arizona，USA)的-NH2)。

或者，连接基团前体DBCO-胺和DBCO-PEG4-胺可如Pola等，2014，Polym.Chem.，5,1340所述制备，聚(N-异丙基丙烯酰胺)叠氮化物封端的(pNiPAM-N3)可以如Xu等人，2007，Macromolecules，40，9103-9110所述制备。

叠氮-PEG3-胺(N3-PEG4-胺)，购自Click Chemistry Tools(Scottsdale，Arizona，USA)。

二苯并环辛炔-NHS酯(DBCO-NHS酯)(式(L-prec2)，其中A是C8杂环烷基环，是二苯并环辛炔，R5是H且R1\'是-E-G-R1\'基团，其中E是-C(O)-，G是乙基，R1\'是用N-羟基琥珀酰亚胺/乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(NHS/EDC)活化的-COOH。

或者，可以如Hiki等，2007，Bioconjugate Chem.，18，2191-2198所述制备连接基团前体N3-PEG4-胺，并且可以如Liu等人，2012，J.Am.Chem.Soc.，134，1886-18888中所述制备DBCO-NHS酯。

使用的其他起始材料如下：

透明质酸(HA)购自Soliance(Pomacle，France)(MW：1.85MDa)；N-(3-二甲基氨基丙基)-N\'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)叠氮化物封端(pNiPAM-N3)(MW：

15kDa)(式(Ia1)，其中R1为如详细描述中所述，其中x为3，R7和R8为甲基，p为132且R2如详述中所述，其中B为-SC(S)-S-，i为11且D为甲基)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)胺封端的(pNiPAM-胺)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。Cyanine5-叠氮化物(Cy5-N3)由Lumiprobe(Hannover，Germany)提供。

HA-B1的合成

根据以下方案1A合成本发明的标题偶合物。

将HA(1)溶解在1％(w/v)的蒸馏水中。在聚合物溶解后，加入EDC(1eq.COO-)并且5分钟后在磁力搅拌下(1200RPM下5min)将NHS溶解(1eq.)。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)用NaOH/HCl 0.1M将pH调节至5.0。DBCO-胺(2)用作如上定义的式(Lprec1)的前体，并加入(1eq.)DMSO，最终体积比为40:60的水-DMSO混合物。将反应物在室温下搅拌过夜，并在乙醇中沉淀，得到式(Ib1)的中间体，其中A是C8杂环烷基环，即二苯并环辛炔，R5是H，R3是-C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-(3)。将沉淀物(3)冻干，再溶于1％(w/v)的蒸馏水中，并加入如上所述用作式(Ia1)中间体的pNiPAM-N3(1eq.)(4)(2小时，在1200RPM)。将HA-P1在蒸馏水中对NaCl 5％(w/v)透析3次(3小时，1500转/分钟)(MWCO 25000,Spectra/膜,Rancho Dominguez,USA)，并在乙醇中沉淀并冻干并储存于4℃。

所得的本发明偶合物HA-B1的结构通过来自Varian(Grenoble，France)光谱的1H NMR Gemini 300MHz(图1D)在室温下使用D2O作为溶剂测定。

方案1A

使用DBCO芳烃质子峰(δ7.67ppm)与HA乙酰基质子峰(δ2.00ppm)的积分的比率，确定HA-DBCO的取代度(DS)为8.0％(1eq.COO-)，使用DBCO芳香族质子峰(δ7.67ppm)与pNiPAM甲基质子峰(δ1.56ppm)的积分的比率，最终将HA-B1的取代度(DS)定量为7.13％(1eq.COO-)。

HA-P2的合成

根据以下方案1B合成本发明的标题偶合物：

HA(1)以1％(w/v)溶解在蒸馏水中。在聚合物溶解后，加入EDC(0.5eq.COO-)并且5分钟后在磁力搅拌下(5分钟，800RPM)将NHS溶解(0.5eq.)。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)用NaOH/HCl0.1M将pH调节至5.0。加入DBCO-PEG4-胺(2P)(0.5eq.)和DMSO，最终为体积比为40:60的水-DMSO混合物。将反应物在室温下搅拌过夜，并在蒸馏水中对NaCl 5％(w/v)在蒸馏水中透析3次(MWCO 12-14000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)(在900RPM下3小时)，得到式(Ib1)的中间体，其中A是C8杂环烷基环，是二苯并环辛炔，R5是H，R3是-C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2-CH2-O)4)-(CH2)2-NH-C(O)-(3P)。将混合物重新溶解在1％(w/v)的蒸馏水中，并加入pNiPAM-N3(0.5eq.)(4)(在1500RPM下2小时)。HA偶合物在蒸馏水中对NaCl 5％(w/v)透析3次(MWCO 25,000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)，然后在900RPM下在3小时期间在蒸馏水中透析3次，冻干并在4℃下储存。本发明的偶合物HA-B2也通过该方法合成，使用DBCO-胺(2)代替DBCO-PEG4-胺(2P)，得到与(HA-B1)相同的偶合物，但具有不同的比例(pNiPAM)/HA)。冷冻干燥后，如上所述，通过D2O中的1H NMR光谱测定所得偶合物的结构和DS(图1F和图1E)。HA-B2和HA-P2的DS分别为7.47％和9.53％(0.5eq.COO-)。

方案1B

HA-B3的合成

根据一般方案2合成本发明的标题偶合物，特别是下面的方案2A。

方案2A

HA(1)以1％(w/v)溶解在蒸馏水中。在聚合物溶解后，加入EDC(1eq.COO-)并且5分钟后在磁力搅拌下(5eq.，1200RPM)将NHS溶解(1eq.)。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)将pH调节至5.0，加入NaOH/HCl 0.1M和N3-PEG4-胺(5)(1eq.)、DMSO，最终为体积比为40:60的水-DMSO混合物。在1500RPM下3小时，HA-N3在蒸馏水中针对NaCl 5％(w/v)透析(MWCO 1000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)3次，在乙醇中沉淀并冻干以产生HA-N3(6)(中间体Ib2，其中R3是基团-C(O)-NH-CH2-O-(CH2-CH2-O)2-CH2-CH2-)。

在磁力搅拌下(在1200RPM下5分钟)，将pNiPAM-胺(7)以1％(w/v)溶解于蒸馏水中。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)将pH调节至7.0，加入NaOH/HCl 0.1M和DBCO-NHS酯(8)(1eq.)用作式(Lprec2)的前体，如如上所定义，其中A是氮杂-二苯并环辛炔基，R5是H，R1\'是(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)4-氧代丁酰基，DMSO的最终体积比为40:60的水-DMSO混合物，产生pNiPAM-DBCO(9)(中间体Ia2，其中A是氮杂-二苯并环辛炔基，R5是H，R3是-C(O)-(CH2)2-C(O)-NH-(CH2)2-S，R2是基团-B-(CH2)iD，其中B不存在，i是0且D是甲基)。将pNiPAM-DBCO在1500RPM下在3小时内对蒸馏水透析3次(MWCO 1,000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)并冻干。

然后将HA-N3(6)在1％(w/v)的蒸馏水中溶解，并加入pNiPAM-DBCO(9)(1eq.)(在1500RPM下2小时)。将HA偶合物在蒸馏水中针对NaCl 5％(w/v)在900rpm下3小时透析(MWCO 25,000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)3次，然后在蒸馏水中在900rpm下3小时透析3次，冻干并在4℃下储存以产生本发明的偶合物HA-B3，特别是式(I)的偶合物，其中M是M2。

HA-pNiPAM(比较对照)的合成

使用如下所述的方法合成不含连接基团的HA-pNiPAM的比较偶合物：将HA以1％(w/v)溶解在蒸馏水中。在聚合物溶解后，加入EDC(1eq.COO-)并且5分钟后在磁力搅拌下(5eq.，1200RPM)将NHS溶解(1eq.)。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)用NaOH/HCl 0.1M将pH调节至5.0，并加入pNiPAM-胺(1eq.)。将反应在室温下搅拌过夜。将HA-pNiPAM在1500RPM下3小时内在蒸馏水中针对NaCl 5％(w/v)透析(MWCO 25,000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)3次，在乙醇中沉淀并冻干并储存于4℃。

HA-P2-Cy5(荧光HA偶合物)的合成

用与HA-P2相同的合成参数，HA偶合物和荧光染料-叠氮化物偶联，除了在加入pNiPAM-N3之前将0.1％(w/w)Cy5-N3加入混合物中。

HA-Cy5的合成(比较荧光对照)

HA(1)以1.5％(w/v)溶解在蒸馏水中。在聚合物溶解后，加入EDC(1.1eq.COO-)并且5分钟后在磁力搅拌下(5分钟，900RPM)将NHS溶解(1.1eq.)。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)用NaOH/HCl 0.1M将pH调节至5.0。加入DBCO-胺(1eq.)和DMSO，产生最终体积比为1：1的水-DMSO混合物。将反应物在室温下搅拌过夜，并在蒸馏水中在900RPM下3小时内针对NaCl 5％(w/v)透析(MWCO 12-14000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)3次，然后在900RPM下3小时内在蒸馏水中透析3次。将混合物以1％(w/v)重新溶解在蒸馏水中，并加入0.1％(w/w)的Cy5-N3(在1500RPM下2小时)。将HA结合物在蒸馏水中在900RPM下3小时内针对NaCl 5％(w/v)透析(MWCO 12-14000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)3次，然后在900RPM下3小时内在蒸馏水中透析3次，冷冻干燥并在4℃下储存。

实例2：本发明的化合物的可注射性

测定低于5N的可注射力的HA偶合物的最大百分比(w/v)，以测试本发明的化合物的可注射性。

用23G针头填充1mL注射器Norm-并使用BD Micro-Fine TM 29G固定针头1mL胰岛素注射器。使用Texture Analyzer TA.XT.plus(Tracomme AG，瑞士)在20℃和37℃下测量注射力。用2个注射器针头系统评估HA偶合物，并显示受注射器材料影响的注射曲线(图2B)。实际上，BD Micro-FineTM29G固定针头是用带有双密封环的柱塞挡止器制成的，用于缓慢抽吸和注射。Fi(初始力)和Fp(平台力)与23G注射器的Ff(最终力)相似且高于Ff(最终力)，29G注射器的Fi Fp Ff，如图2所示。HA-B1、HA-B2和HA-P2的浓度分别为7.5％、0.5％和0.75％(w/v)被认为易于注射( 5N)。这些结果揭示了本发明的HA偶合物的优异注射性和根据注射系统可能增加的最大浓度。

实例3：本发明的化合物的流变行为

研究了本发明的化合物的流变行为如下：

在0.4mL HA-B1(7.5％w/v)、HA-B2(0.5％w/v)、HA-P2(0.75％w/v)和(1％w/v)样品上进行流变学测量，Haake Rheostress 1使用具有35/2°Ti锥(Vreden，德国)的锥板几何形状，并且在20℃下在受控湿度室中的剪切速率为0.1s-1至100s-1。

结果表明，本发明的所有HA接枝聚合物和都是非牛顿流体和假塑性流体。假塑性流体的粘度随着剪切的增加而降低，这是促进注射的有利性质。

还通过动态流变测定法G\'(弹性)和G\'(粘度)模量研究了下临界溶解温度(LCST)，其作为加热速率为1℃/min的温度的函数。LCST由G\'和G”模量的交集表征。所有HA偶合物显示临界温度，低于该临界温度，混合物可混溶(LCST)：HA-P1为24-25℃，HA-B2和HA-P2为31-32℃。本发明的所有HA接枝聚合物都是溶液(G” G\')，与不同，在HA-P2的情况下，G\'和G”值迅速增加，尤其是弹性性质(G\')，与HA-B1不同。pNiPAM和连接基团的接枝影响纳米颗粒的形成，并进而改变LCST以上的流变性质，表明双相纳米颗粒-溶剂混合物。

实例4：本发明的偶合物的颗粒的尺寸和形态

将本发明的HA接枝聚合物溶解在蒸馏水中，并将HA接枝聚合物溶液在37℃下孵育，从而形成纳米颗粒。

通过三种方法在LCST以上测定如此形成的HA纳米颗粒的平均颗粒尺寸：扫描电子显微镜(SEM)(Jeol Microscope，JSM-7001TA，Tokyo，Japan)显微图像，通过使用Image J版本1.45s分析软件(NIH，USA)、动态光散射(DLS)(Nanosizer，Malvern，England)和纳米粒子跟踪分析(NTA)(NanoSight LM10，Malvern，England)测量50个颗粒的直径。SEM分析揭示了在37℃孵育后HA偶合物的纳米颗粒形态，如图3所示。与其他HA偶合物相比，HA-B1纳米颗粒更小且非常球形。pNiPAM/HA的高接枝率影响纳米颗粒的球形形成(图3ABC)以及作为温度的函数的粘度/弹性。对于HA-P2(图3B)，纳米颗粒大小显示PEG4连接基团的影响。此外，与HA-B2的快速可逆转变不同，HA-P2纳米颗粒在LCST(31-32℃)以下缓慢再溶解(图3E)。明显地，PEG4连接基团影响HA偶合物的溶解度和形成的纳米颗粒尺寸(表1)。

表1

相比之下，没有连接基团的水凝胶和接枝聚合物HA-pNiPAM(阴性对照)(图3D)在加热时根本不形成纳米颗粒。

实例5：活体荧光

如下评估本发明的偶合物的体内停留时间：

在小鼠中通过两种注射途径给药(健康皮下组织和膝关节骨性关节炎中的关节内注射)后，评估小鼠的活体荧光的HA-P2-Cy5和HA-Cy5(比较对照)。将HA-P2-Cy5和HA-Cy5溶液(1％w/v)注射到关节(n＝7)和皮下(n＝4)。

在HA-Cy5的情况下，观察到显著差异。7天后，关节内注射的总信号减小，皮下部位的像素面积增加。HA-Cy5在注射部位显示短暂的停留时间(图5)。HA-P2-Cy5在体温下自发形成纳米颗粒。像素面积的增加通过平均信号的减小来平衡。显然，未发现HA-P2-Cy5的总信号的显著差异。由于自发的纳米颗粒形成，HA偶合物在注射部位的体内显示出长的停留时间(图5)。

实例6：生物相容性

本发明的偶合物的生物相容性评估如下：

在HA-P2-Cy5的健康小鼠中皮下注射7天(n＝4)和21天(n＝4)后，去除皮肤片，检测到花青素(Cyanine)5荧光，并在矢状平面切割。嵌入石蜡后，用切片机切割4μm切片。切片用苏木精-伊红(HE)染色。注射部位的HA-P2-Cy5的生物相容性由组织/材料相互作用控制。确认HA-P2-Cy5在皮下注射21天后的相互作用和生物相容性。与对照组相比，巨噬细胞、组织反应中的主要细胞在周围组织中并不多。

实例7：体外药物释放

为了从本发明的HA接枝聚合物的纳米颗粒确定药物释放曲线，如下进行体外药物释放。盐溶液(NaCl 0.9％)、本发明的接枝聚合物HA-B2和HA-P2被地塞米松碱(药物)饱和。将10mL之前的溶液置于透析袋(MWCO 1,000，Spectra/膜，Rancho Dominguez，USA)中，针对400mL NaCl 0.9％(w/v)，并在37℃和80RPM下孵育。28小时后，通过加热(121℃)水解聚合物基质，释放其剩余的地塞米松含量，并加入DMSO至最终体积比为1：1的水：DMSO。使用C18 Hypersil Gold柱(50/2.1,1.9μm珠粒度，Thermo Scientific，Waltham，USA)通过反相UHPLC定量在每个时间点释放的药物。流动相包含0.1％v/v甲酸水溶液(A)和乙腈溶液(B)中的0.1％v/v三氟乙酸(TFA)，使用梯度洗脱，30-95％A(0-3分钟)，95-10％A(3-4分钟)，10-30％A(4-4.5分钟)和30％A(4.5-5分钟)，流速为400μL.min-1。

与对照(盐溶液和)相比，HA接枝聚合物吸收的地塞米松多约2.5倍。如图4所示，在破坏(t＝30小时)后，40％的地塞米松仍然在HA偶合物的纳米颗粒内。

在LCST之上，HA偶合物纳米颗粒载有疏水性药物物质作为地塞米松碱。该研究证明了本发明的HA偶合物纳米颗粒作为新的药物输送系统的高效率。

实例8：稳定性

通过流变学和pH/zeta电位测量评估本发明的接枝聚合物的稳定性如下：

将HA接枝聚合物储存在4℃，并随时间检查粘度(t0、t7和t30)。使用具有35/2°Ti锥的锥板几何形状和对数剪切速率模式，使用Haake Rheostress 1对0.4mL HA-B2(0.5％w/v)和HA-P2(0.75％w/v)样品进行流变学测量(Vreden，德国)，在20℃下在受控湿度室中的范围为0.1s-1至100s-1。用pH凝胶电极Metrohm(Herisau，Switzerland)测量pH，并使用Zetasizer NanoZS(Malvern，Worcestershire，UK)测量Zeta电位。

没有观察到显著的粘度差异，表明接枝聚合物HA-B2和HA-P2在4℃下稳定1个月。HA接枝聚合物显示具有高zeta电位的酸性pH，确保胶体稳定性(表2)。为了中和pH，将HA接枝聚合物溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用于体外/体内实验。

表2

实例9：细胞活力测定

使用人滑膜成纤维细胞进行活力测试。将细胞以20000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。24小时后，将HA偶合物(HA-B2和HA-P2)溶解在PBS中，并在37℃下孵育24小时。向每个孔中加入50μL 0.5％MTT溶液3小时。将所有孔与100μL DMSO一起孵育45分钟，并通过BioTeK Synergy Mx(Winooski，USA)在570nm(每孔8个点)测量吸光度。

与未处理的对照相比，PBS中的HA-B2 0.75％(w/v)和HA-P2 0.5％(w/v)不会降低细胞活力。